醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法

1  范圍：本標準規定了醫藥工業潔凈室和潔凈區中浮游菌測試條件、測試方法。本標準適用于醫藥工業潔凈室和潔凈區，無菌室或無菌區域（包括潔凈工作臺）的浮游菌的測定和環境的驗證。

2  引用標準：下列標準包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均為有效。所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

3  定義：本標準采用下列定義。

3.1  潔凈室（區）clean room（area）：對塵粒及微生物污染規定需進行環境控制的房間或區域。其建筑結構、裝備及其使用均具有減少對該區域內污染源的介入、產生和滯留的功能。

3.2  潔凈工作臺  cleaning work station：一種工作臺或者與之類似的一個封閉圍擋工作區。其特點是自身能夠供給經過過濾的空氣或氣體，如垂直層流罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺、水平層流潔凈工作臺、自凈器等。

3.3  菌落  colony forming units：細菌培養后，由一個或幾個細菌繁殖而形成的一細菌集落，簡稱CFU。通常用個數表示。

3.4  浮游菌  airborne microbe：用本標準提及的方法收集懸浮在空氣中的活微生物粒子，通過專門的培養基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。

3.5  浮游菌濃度  airborne microbe concentration：單位體積空氣中含浮游菌菌落數的多少，以計數濃度表示，單位是個/m3或個/L。

3.6  懸浮粒子  airborne particles：可懸浮在空氣中的尺寸一般在0.001μm～1000μm之間的固體、液體或兩者的混合物質，包括生物性粒子和非生物性粒子。

3.7  潔凈度  cleanliness：潔凈環境內單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑的懸浮粒子的允許統計數。

3.8  單向流  unidirectional air flow（曾稱為層流laminar flow）：沿著平行流線，以單一通路以一定流速向單一方向流動的氣流。

3.9  非單向流  nonunidirectional air flow（曾稱為亂流turbulent flow）：具有多個通路循環特性或氣流方向不平行的，不滿足單向流定義的氣流。

3.10  靜態測試  at-rest test：潔凈室（區）凈化空氣調節系統已處于正常運行狀態，工藝設備已安裝，潔凈室（區）內沒有生產人員的情況下進行的測試。

3.11  動態測試  operational test：潔凈室（區）已處于正常生產狀態下進行的測試。

4  測試方法

4.1  方法提要：本方法采用計數濃度法，即通過收集懸游在空氣中的生物性粒子于專門的培養基，經若干時間，在適宜的生長條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數，從而判定潔凈環境內單位體積空氣中的活微生物數，以此來評定潔凈室（區）的潔凈度。

4.2  所用的儀器、設備和培養基： a）浮游菌采樣器；b）真空抽氣泵；c）培養皿；d）培養基；e）恒溫培養箱。

4.3  浮游菌采樣器：浮游菌采樣器宜采用撞擊法機理的采樣器，一般采用狹縫式采樣器或離心式采樣器。

4.3.1  采用的浮游菌采樣器必須要有流量計和定時器。

4.3.2  狹縫式采樣器的原理：狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣，通過采樣器的縫隙式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉的平板培養基表面上，附著的活微生物粒子經培養后形成菌落，予以計數。

4.3.3  離心式采樣器的原理：離心式采樣器由于內部風機的高速旋轉，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到專用的固形培養條上，經培養后形成菌落，予以計數。

4.3.4  狹縫式采樣器的使用要點：應嚴格按儀器說明書的要求進行操作。

4.3.4.1  校驗：采樣器必須按儀器的檢定周期，定期對儀器作檢定，以保證測試數據的可靠性。校驗的項目有：定時器、轉盤轉速、流量計。

4.3.2  每次測試前應按說明書上的規定，先接通電源，啟動真空抽氣泵，然后調節流量計及定時器。

4.3.4.3  空氣采樣量根據需要選定。已知采樣器的流量（L/min），設定采樣時間（min），兩者相乘即采樣量（L）。

4.3.4.4  注意事項

4.3.4.4.1  采樣口必須用便于消毒及化學性能穩定的材料制造。

4.3.4.4.2  采樣管嚴禁滲漏，內壁應光滑。

4.3.4.4.3  采樣管的長度應根據測點的高度定，盡量減少彎曲。

4.4  真空抽氣泵

4.4.1  真空抽氣泵的排氣量應與采樣器匹配。

4.4.2   宜采用無油真空抽氣泵，必要時可在非氣口安裝氣體過濾器。

4.4.3  真空抽氣泵安裝的位置必須適當，一般裝在采樣器下面。

4.5  培養皿

4.5.1  狹縫式采樣器一般采用? 150mm×15mm、? 90mm×15mm、? 65mm×15mm三種規格的硼硅酸玻璃培養皿?？筛鶕x用采樣器選擇合適的培養皿。

4.5.2  離心式采樣器采用專用的固形培養條。

4.6  培養基：普通肉湯瓊脂培養基或其他藥典認可的培養基。其配制方法見附錄A（標準的附錄）。

4.7  恒溫培養箱：必須定期對培養箱的溫度計進行檢定。

4.8  測試步驟

4.8.1  測試前儀器、培養皿表面必須嚴格消毒。

4.8.1.1  采樣器進入被測房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，用于100級潔凈室的采樣器宜一直放在被測房間內。

4.8.1.2  用消毒劑擦凈培養皿的外表面。

4.8.1.3  采樣前，先用消毒劑消毒采樣器的頂蓋、轉盤以及罩子的內外面，采樣結束，再用消毒劑輕輕噴射罩子的內壁和轉盤。

4.8.1.4  采樣口及采樣管，使用前必須高溫滅菌。如用消毒劑對采樣管的外壁及內壁進行消毒時，應將管中的殘留液倒掉并晾干。

4.8.1.5  采樣者應穿戴與被測潔凈區域相應的工作服，在轉盤上放入或調換培養皿前，雙手用消毒劑消毒。

4.8.2  狹縫式采樣器的采樣程序

4.8.2.1  儀器經消毒后先不放入培養皿，開動真空泵抽氣，使儀器中的殘余消毒劑蒸發，時間不少于5min，并調好流量、轉盤轉速。

4.8.2.2  關閉真空泵，放入培養皿，蓋上蓋子后調節采樣器縫隙高度。

4.8.2.3  置采樣口于采樣點后，依次開啟采樣器、真空泵，轉動定時器，根據采樣量設定采樣時間。

4.8.3  培養

4.8.3.1  全部采樣結束后，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。

4.8.3.2  在30℃～35℃培養箱中培養，時間不少于48h。

4.8.3.3  每批培養基應有對照試驗，檢驗培養基本身是否污染?？擅颗x定3只培養皿作對照培養。

4.8.4  菌落計數

4.8.4.1  用肉眼直接計數、標記或在菌落計數器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

4.8.4.2  若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數。

4.8.5  注意事項

4.8.5.1  使用前仔細檢查每個培養皿的質量，培養基及培養皿有變質、破損或污染的不能使用。

4.8.5.2  采取一切措施防止采樣管的污染和其他人為對樣本的污染。

4.8.5.3  對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。

4.8.5.4  由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落或培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。

5  測試規則

5.1  測試狀態

5.1.1  浮游菌測試前，被測試潔凈室（或潔凈區）溫、濕度須達到規定的要求，靜壓差、換氣次數、空氣流速必須控制在規定值內。

5.1.2  浮游菌測試前，被測試潔凈室（或潔凈區）已經過消毒。

5.1.3  測試狀態有靜態和動態兩種，測試狀態的選擇必須符合生產的要求，并在報告中注明測試狀態。

5.2  測試人員

5.2.1  測試人員必須穿戴符合環境級別的工作服。

5.2.2  靜態測試時，室內測試人員不得多于2人。

5.3  測試時間

5.3.1  對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調系統正常運行不少于10 min后開始。

5.3.2  對非單向流，如10 000級，100 000級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統正常運行不少于30 min后開始。

5.4  浮游菌濃度計算

5.4.1  采樣點數量及其布置

5.4.1.1  最少采樣點數目：浮游菌測試的最少采樣點數目分為日常監測及環境驗證兩種情況。

表1  最少采樣點數目

b）對每個10 000級潔凈工作區域（如藥物開口工作區）可在工作面處設測點，每班一次。

5.4.1.2  采樣點的位置：采樣點位置可以同懸浮粒子測試點。

a）工作區測點位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）。b）送風口測點位置離開送風面30cm左右。c）可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點。

5.4.2  最小采樣量：采樣量根據日常檢測及環境驗證定，每次最小采樣量見表2。

表2  最小采樣量

5.4.4  采樣注意事項

5.4.4.1  對于單向流或送風口，采樣器采樣管口朝向應正對氣流方向；對于非單向流，采樣管口向上。

5.4.4.2  布置采樣點時，至少應離開塵粒較集中的回風口1m以上。

5.4.4.3  采樣時，測試人員應站在采樣口的下風側。

5.5  記錄測試報告中應記錄房間溫度、相對濕度、壓差及測試狀態。測試報告的編寫見附錄C（標準的附錄）。

5.6  結果計算

5.6.1  用計數方法得出各個培養皿的菌落數。

5.7  結果評定：用浮游菌平均濃度判斷潔凈室（區）空氣中的微生物。

5.7.1  每個測點的浮游菌平均濃度必須低于所選定的評定標準中關于細菌濃度的界限。

5.7.2  若某測點的浮游菌平均濃度超過評定標準，則必須對此區域先行消毒，然后重新采樣兩次，兩次測試結果必須合格。

附錄A（標準的附錄）培養基的準備及滅菌

A1 培養基的準備：培養基外購或自行配制。自行配制方法見YY/T0188.6第6章無菌檢查部分中關于此類培養基的配備和操作步驟。其他符合藥典靈敏度要求的培養基亦可以自行配制。

A2  培養基平皿的制備

A2.1  將培養皿置于121℃濕熱滅菌20min或180℃干熱滅菌2h。

A2.2  將培養基加熱熔化，冷卻至45℃時，在無菌操作要求下將培養基注入培養皿。

       注入量：?65mm培養皿      約10mL

               ?90mm培養皿      約20mL

               ?150mm培養皿     約60mL

A3  細菌的培養：待瓊脂凝固后，將培養基平皿倒置于30℃～35℃的恒溫培養箱中培養48h，若培養基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用。注：培養基平皿宜在2℃～8℃的環境中存放。附錄B（標準的附錄）：采樣點布置潔凈室和潔凈區采樣點的布置力求均勻，避免采樣點在某局部區域過于集中，某局部區域于稀疏。下列采樣點布置的圖示可作參考。

附錄C（標準的附錄）浮游菌測試報告

表D1潔凈室潔凈度級別美國NASA標準